Жидкостная хроматография

Высокоэффективная жидкостная хроматография - хроматография, в которой подвижной фазой является жидкость.

Жидкостную хроматографию классифицируют следующим образом:

- нормально-фазовая хроматография - такой вариант ВЭЖХ, когда подвижная фаза менее полярна, чем неподвижная, и есть основания считать, что основной фактор, определяющий удерживание, - это взаимодействие сорбатов непосредственно с поверхностью либо объемом сорбента;

- обращенно-фазовая хроматография - такой вариант ВЭЖХ, когда подвижная фаза более полярна, чем неподвижная, и удерживание определяется непосредственным контактом молекул сорбата с поверхностью или объемом сорбента; при этом ионизированные сорбаты не обмениваются на ионы подвижной фазы, сорбированные на поверхности;

- ионнообменная хроматография - такой вариант обращенно-фазовой хроматографии, позволяющий разделять ионы и полярные молекулы на основании зарядов разделяемых молекул

- эксклюзионная хроматография - способ разделения соединений по их молекулярным массам, основанный на различии в скорости диффузии в порах неподвижной фазы молекул различных размеров.

Хроматографическая колонка - центральная, принципиально важная часть хроматографической системы. В абстрактном виде колонку можно представить как цилиндрический слой неподвижной фазы, взаимодействующий в процессе хроматографического разделения с подвижной фазой и растворенным в ней сорбатом.

Молекулы сорбата мигрируют по колонке, когда они находятся в подвижной фазе, и остаются на месте, когда находятся в неподвижной фазе. Чем больше сродство сорбата к неподвижной фазе и чем меньше - к подвижной, тем медленнее он движется по колонке и тем дольше в ней удерживается. За счет различия в сродстве компонентов смеси к неподвижной и подвижной фазам достигается основная цель хроматографии - разделение за приемлимый промежуток времени смеси на отдельные концентрационные зоны (пики) компонентов по мере их продвижения по колонке с подвижной фазой.

Хроматографическое разделение возможно только в том случае, если компоненты образца, попадая в колонку при вводе пробы, во первых, будут растворены в подвижной фазе и, во вторых, будут обратимо взаимодействовать с неподвижной фазой. Если при вводе пробы какие-то компоненты находятся не в виде раствора, они будут отфильтрованы и не будут участвовать в хроматографическом процессе. Точно так же компоненты, не взаимодействующие с с неподвижной фазой, пройдут через колонку вместе с фронтом подвижной фазы, не разделяясь на индивидуальные пики.

Сорбенты для высокоэффективной жидкостной хроматографии

Модифицированными сорбентами с химически привитыми группами, используемыми в обращенно-фазовой хроматографии являются силикагели, на поверхностях которых по связям Si-C- ковалентно привиты алкильные группы С2, С8, октадецильные группы С18, фенильные, алкиламино-, амино-, нитро- и диольные группы.

Наиболее распространенными в практике обращенно-фазовой хроматографии из указанных сорбентов являются октадецильные фазы (С18). Привиты сорбенты разных производителей отличаются как по типу модификатора, так и по его концентрации и концентрации оставшихся после прививки силанольных групп на поверхности силикагеля.

Недостатками обращенно-фазовых сорбентов на основе силикагеля являются ограниченно допустимый диапазон pH и сорбционная активность остаточных силанольных групп. С этим недостатком в результате в результате качественного эндкеппинга и других усовершенствований удается справляться лидеру по производству колонок нового поколения американской компании Phenomenex (например, одна из наиболее популярных обращенно-фазовых колонок в мире - Luna C18 - обладает стабильностью в диапазоне значений pH 1.5-10.

Cвойства сорбентов Luna

Сорбенты для работы на водных обращенных фазах

Одной из основных проблем, связанных с эксплуатацией обращенно-фазовых колонок, являются невозможность использования 100% водного элюента, а следовательно и трудности при разделении высокополярных органических соединений, например карбоновых кислот или некоторыз водорастворимых витаминов. 100% водный элюент не проникает в поры привитого сорбента, при этом резко уменьшается контакт анализируемых соединений с неподвижной фазой, что ведет, в свою очередь к значительному снижению времен удерживания.

Несмотря на то, что в ряде случаев от обычной колонки С18 можно добиться приемлимой стабильности в условиях 100% водной подвижной фазы (размер пор должен превышать 22 нм, рабочая температура колонки должна быть ниже 10 С или 5 мМ ион парного реагента должно быть добавлено в элюент), последние несколько лет ознаменовались появлением на мировом хроматографическом рынке целого ряда специфических-обращенно фазовых колонок, предназначенных для разделения высокополярных соединений с применением подвижных фаз с высоким содержанием воды. Самой распространенной разновидностью таких колонок являются колонки с так называемой "полярной вставкой" . В них полярные функциональные группы такие как, амидная, карбаматная или эфирная, вводятся в алкильную цепочку привитой фазы как можно ближе к поверхности силикагеля. Изначально колонки с "полярной вставкой" , в частности амидной, использовались благодаря своей способности деактивировать взаимодействия остаточных силанольных групп с основными компонентами пробы. Впоследствии была обнаружена способность данного типа колонок к стабильной работе в условиях водных подвижных фаз (даже при работе на 100 % водном элюенте привитая фаза находтся в смоченном состоянии, а алкильные цепи сохраняют конформационную подвижность и способность взаимодействовать с компонентами пробы), а также улучшенная селективность по отношению к полярным соединениям.

На рисунке изображена рабочая поверхность сорбента колонки Synergi Polar-RP (Phenomenex, США), являющейся характерным представителем колонок с эфирной группой в качестве "полярной вставки"

Жидкостная хроматография

Оборудование